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　　本生帶您了解：ELISA實(shí)驗中常見(jiàn)問(wèn)題和注意事項
 

　　用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清(漿)。本實(shí)驗室用ELISA測定乙肝兩對半，甲肝，戊肝，抗HIV的標本時(shí)，在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

　　1)要注意避免出現嚴重溶血及血清中混有紅細胞。當標本出現嚴重溶血及血清中混有紅細胞時(shí)，反應孔不易洗凈，殘留在反應孔內的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的活性，顯色時(shí)可能造成假陽(yáng)性。

　　2)標本凝固不全強行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實(shí)驗過(guò)程中形成纖維蛋白吸附在反應孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結果。

　　3)血清標本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長(cháng)時(shí)間保存，則需放入-20℃冰柜內冰凍保存。冰凍保存的血清標本須注意避免反復凍融，標本可能引起假陰性結果。此外凍融標本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應反復顛倒混勻。

　　ELISA測定中試劑準備：

　　在實(shí)驗開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來(lái)直接做實(shí)驗會(huì )造成一些弱陽(yáng)性標本的檢測出現假陰性。因為在后面的孵育反應步驟中，造成孵育時(shí)間不夠。其次，ELISA實(shí)驗中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應保證質(zhì)量。

　　加血清樣本及反應試劑：

　　血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn)：

　　1)加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時(shí)，加樣槍需按到第一檔，加樣時(shí)，加樣槍需直接按到底。

　　2)加樣應直接加入反應孔底部，加在反應孔孔壁上易濺出會(huì )對鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現氣泡。

　　3)反應試劑的加入時(shí)先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現重復滴加或加在兩孔之間。

　　溫育的時(shí)間與溫度：

　　溫育是ELISA測定中最容易出現問(wèn)題的步驟。溫育溫度應在37℃，水浴。溫育時(shí)間應按照試劑說(shuō)明書(shū)上的時(shí)間嚴格執行。溫育實(shí)際測定操作中要注意以下幾點(diǎn)：

　　1)要保證在設定的溫度下有足夠的反應時(shí)間。溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測不出來(lái)。

　　2)因為采用水浴，所以在溫育時(shí)一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應孔內造成污染，并有可能整板花板。

　　ELISA測定的洗板：

　　全自動(dòng)洗板機的使用應注意以下幾點(diǎn)：

　　1)洗板前，應檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿(mǎn)瓶

　　2)在自檢過(guò)程中注意觀(guān)察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3)在洗板過(guò)程中，應注意觀(guān)察反應孔每孔是否灌滿(mǎn)且無(wú)外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時(shí)間。

　　BUNSEN本生提醒：ELISA測定以TMB為底物的顯色

　　加入底物開(kāi)始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測定判斷結果。在此過(guò)程中應注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實(shí)驗。

　　ELISA的比色測定

　　ELISA的比色測定由酶標儀進(jìn)行測定，故需強調比色測定時(shí)，一定要注意酶標儀的波長(cháng)是否是雙波長(cháng)(450nm和630nm)。

　　ELISA測定結果判定

　　結果判定一般是根據比色結果和肉眼觀(guān)察綜合判定。如在判定過(guò)程發(fā)現有些反應孔出現倒陰不陽(yáng)的現象或出現不常見(jiàn)的模式(如乙肝兩對半中出現12陽(yáng)性等)，需本著(zhù)嚴謹的態(tài)度，重新復查。

　　對ELISA測定中出現問(wèn)題的可能原因(非試劑盒本身的原因)，總結如下：

　　1)弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測不出溫育的時(shí)間或溫度不夠;顯色反應時(shí)間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題。

　　2)測定的重復性差，這是由于測定操作引起的問(wèn)題，包括

　?、偌訕颖炯霸噭┝坎粶?孔間不一致

　?、诩訕舆^(guò)快，孔間發(fā)生污染

　?、奂渝e樣本

　?、芗訕颖炯霸噭r(shí)，加在孔壁

　?、莶煌栐噭┖兄薪M分混用

　?、逌赜龝r(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致

　?、呖變任廴倦s物，

　　血清標本未凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽(yáng)性等。

　　3)全部孔都不顯色

　?、俾┘用附Y合物;

　?、谙窗逡号渲浦谐霈F問(wèn)題

　?、勐┘语@色劑A或B

　?、芙K止劑當顯色劑使用

　　4)全部板孔均有顯色

　?、侔宀桓蓛?/p>

　?、陲@色液變質(zhì)

　?、巯窗逡菏苊傅任廴?/p>

　　ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿(mǎn)足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏(yíng)，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng )美好的未來(lái)。