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BUNSEN本生帶你分析影響ELISA中非特異性顯色的原因
更新時(shí)間:2023-09-19瀏覽:520次

  BUNSEN本生帶你分析影響ELISA中非特異性顯色的原因


  影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過(guò)程中的問(wèn)題。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過(guò)以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實(shí)驗結果。

  試劑盒特異性因素

  1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板為常見(jiàn)。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時(shí)要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認證,評估。

  2.包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

  3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。

  4 .封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2],減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

  


  檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

  1.內源性干擾物:類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等,類(lèi)風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,多數為IgM類(lèi),能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現非特異性顯色。

  黃疸血標本中常含有內源性過(guò)氧化物酶,如用辣根過(guò)氧化物酶為標記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。

  2 .外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等。溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類(lèi)似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP(辣根過(guò)氧化酶)[2],有國內報道酶免HAg試劑檢測溶血標本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3]。如在冰箱中保存過(guò)久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標本在采集處理時(shí)應小心,在冰箱中保存不易過(guò)久。

  標本凝集不全時(shí),血清中會(huì )殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽(yáng)性。

  操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性

  1.加樣

  對于間接ELISA標本一般都要進(jìn)行稀釋?zhuān)绻訕硬粶示蜁?huì )造成誤差,尤其當稀釋倍數大時(shí),很小的絕對誤差,會(huì )導致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽(yáng)性)標本呈陽(yáng)性(或陰性)。加樣時(shí)應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。目,大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統處理標本,可較好地避免以上誤差。

  2.洗滌

  在ELISA中正確的洗滌是得到可重復結果的關(guān)健一步,應引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來(lái)達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結合的物質(zhì),以及在反應過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

  3 .溫育

  每種試劑都有其反應模式,其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應時(shí)間長(cháng),會(huì )造成整板本底高,陽(yáng)性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應加蓋。

  4.酶標儀判讀

  作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩定與否,決定結果的可靠度。先酶標儀應定期進(jìn)行保養,對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長(cháng)設置要正確,使用雙波長(cháng),一個(gè)檢測波長(cháng),一個(gè)參比波長(cháng),以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標儀讀數時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說(shuō)明書(shū)


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