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　　ELISA實(shí)驗：哪些因素會(huì )導致ELISA實(shí)驗的假陽(yáng)性

　　ELISA法對IgG、IgM都有很好的檢測能力，因其靈敏度高，價(jià)格低廉，操作方便，結果客觀(guān)，在實(shí)驗室廣泛應用，但在工作中遇到的zui大的問(wèn)題是出現假陽(yáng)性的問(wèn)題。影響因素除了方法學(xué)、試劑盒本身之外,還有標本處理、操作不當等多種因素，雙試劑兩組結果進(jìn)行配對t檢驗，差異(P>0.05)均無(wú)統計學(xué)意義。

　　多種因素可能會(huì )導致ELISA法本底偏高。出現灰值，除了嚴格操作、做好質(zhì)控外，對可疑假陽(yáng)性的標本一定要認真復測。為避免假陽(yáng)性結果的出現現將產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因分析如下：

　　1、內源性因素

　　(1)年齡因素

　　老年人容易出現免疫功能異常，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結果出現假陽(yáng)性。

　　(2)疾病因素

　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內含有嗜異性抗體，自身抗體、類(lèi)風(fēng)濕因子等，這些特殊成分在反應過(guò)程中有一定的吸附作用，多為體內某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應而出現假陽(yáng)性。

　　2、標本因素

　　(1)標本處理不chedi

　　血液抽出后未wan全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原wan全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不che底干凈，酶殘留在反應孔中，使反應孔吸光度值偏高，出現假陽(yáng)性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質(zhì)易沉淀或附著(zhù)在聚乙烯空內不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉速(3000/min)和較長(cháng)的離心時(shí)間(>10/min)之上，血液標本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時(shí)避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結果的影響。

　　(2)標本溶血

　　標本溶血時(shí)細胞內液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結合，洗滌時(shí)不易洗去，催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應，使本底吸光度值偏高形成假陽(yáng)性。

　　(3)細菌污染

　　標本放置、處置不當被細菌污染，一些細菌體內可能含有內源性辣根過(guò)氧化物酶會(huì )對相應的酶做標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾，造成弱的假陽(yáng)性反應。

　　3、操作因素

　　聚苯乙烯因其具有較長(cháng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過(guò)洗滌清楚在反應過(guò)程中，非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻決定著(zhù)試驗的成敗，可以在加樣前離心時(shí)得以控制，BUNSEN本生試劑盒 同樣也可以通過(guò)適當增加洗滌的次數和浸泡時(shí)間減輕或避免對試驗結果的影響，同樣對于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時(shí)將其去除，那么解決的時(shí)機就是洗滌過(guò)程。

　　(1)加樣太快，加樣時(shí)加在孔壁上或有氣泡。

　　(2)底物液反復使用被污染或被強光照射時(shí)間過(guò)長(cháng)。

　　(3)板要平整，尤其是在洗板機洗板的過(guò)程中,往往是3排一起洗，如果板不平,就很可能造成洗液有殘留，從而導致非特異性結合不能清除干凈，對實(shí)驗結果造成干擾。

　　(4)洗液溫度 實(shí)驗表明:洗液溫度也會(huì )影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現“花板"問(wèn)題，因此，需保持在室溫在20-30℃。

　　洗液未注滿(mǎn)孔，孔壁洗滌不干凈也易造成假陽(yáng)性現象。

　　(5)洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配置，放置時(shí)間過(guò)長(cháng)易產(chǎn)生絮狀物或渾濁，造成賭孔導致假陽(yáng)性。

　　洗板次數不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì )造成由于洗板不凈而造成假陽(yáng)性，孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)也會(huì )造成假陽(yáng)性;由于樣本較多，加樣后未及時(shí)放入孵育箱，反應板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(cháng)，既間接增加了孵育時(shí)間，導致孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)。

　　4、儀器因素

　　(1)酶標儀是垂直對反應孔比色，反應孔底部污染時(shí)，出現反應孔吸光度值偏高。

　　(2)洗板拖尾現象，洗板機在洗板過(guò)程中，出水針出水不暢，滴滴答答不間斷出現水滴，造成板上水過(guò)多，拍板不干凈。

　　5、方法學(xué)因素

　　(1)廠(chǎng)家試劑盒，BUNSEN本生試劑盒 由于不同廠(chǎng)家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測抗體，被某些身體不明抗原干擾，導致的假陽(yáng)性。

　　(2)實(shí)驗灰區，在陽(yáng)性與陰性之間有一條明顯的分界線(xiàn)，作為陽(yáng)性判定值(cutoff)來(lái)判定結果，一般把檢測值S/COV值在0.6-1范圍內時(shí)作為灰區帶，因此當1

　　(3)“鉤狀效應"的產(chǎn)生，需對標本進(jìn)行稀釋重復檢測。

　　(4)酶標儀的波長(cháng)選擇，建議酶標儀比色時(shí)選擇雙波長(cháng)，即敏感波長(cháng)(主波長(cháng))和非敏感干擾波長(cháng)(次波長(cháng))，zui后從儀器上得到的讀數為敏感波長(cháng)與非敏感干擾波長(cháng)之差，排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。

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