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免疫組化技術(shù)與Western blotting、ELISA的異同、ELISA類(lèi)型
1)Western blotting
蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來(lái)檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準確;當然Western blotting也可定性和定位(通過(guò)提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位)，但敏感性遠遠低于免疫組化技術(shù)。
2)ELISA
酶聯(lián)免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結合反應原理來(lái)檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術(shù)相比，定量準確，是分泌性蛋白檢測選方法之一。
(一)雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，操作步驟如下：
(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)。
(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時(shí)間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。
(3)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。洗滌未結合的酶標抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
(4)加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據顏色反應的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
(二)雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)，如應用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時(shí)可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應時(shí)間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著(zhù)提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應(hookeffect)，類(lèi)同于沉淀反應中抗原過(guò)剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應嚴重時(shí)甚至可出現假陰性結果。
(三)間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。操作步驟如下：
(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質(zhì)。
(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結合，在洗滌過(guò)程中被洗去。
(3)加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。
(四)競爭法
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無(wú)抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會(huì )與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會(huì )，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達充分的量。洗滌。 (3)加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。
(五)捕獲法測IgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì )干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：
(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
(2)加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
(4)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應。
(六)應用親和素和生物素的ELISA
親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結合?，F在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱(chēng)維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結合就為穩定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類(lèi)似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過(guò)親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素-酶結合物，以放大反應信號。
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