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　　本生一秒帶您看懂——酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)

　　酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是的標記免疫分析技術(shù)之一。

　　它基于一種酶標記抗體，能夠檢測固定在96孔或384孔酶標板上的抗原，加入的底物可以產(chǎn)生與原始樣品中存在的抗原量相關(guān)的顏色變化或光信號。這是一種簡(jiǎn)單而快速的技術(shù)，用于檢測附著(zhù)在固體表面的抗體或抗原。作為最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在實(shí)驗室研究、疾病生物標志物診斷和各個(gè)行業(yè)的質(zhì)量控制方面具有商業(yè)價(jià)值。

　　ELISA的主要類(lèi)型

　　根據抗原固定策略、抗體標記策略以及抗體-抗原反應類(lèi)型(直接識別或競爭)的不同，ELISA可以分為：

　　直接法、間接法、夾心法、競爭法。

　　直接法ELISA

　　直接法ELISA是的ELISA形式?？乖ㄟ^(guò)一段時(shí)間的孵化被動(dòng)地附著(zhù)在酶標板孔底部。在簡(jiǎn)單的洗滌步驟后，通過(guò)添加與酶共價(jià)連接的抗體來(lái)檢測抗原。孵化和洗滌后，通過(guò)添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時(shí)間后，或在規定時(shí)間通過(guò)化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。

　　由于只涉及一個(gè)抗體，所以直接法ELISA適用于樣品中抗原的定性或定量檢測、抗體篩選和表位基因圖譜。這種方法沒(méi)有交叉反應的二抗，可以在更短的時(shí)間內進(jìn)行檢測。然而，一抗的免疫反應可能會(huì )受到酶標記的不利影響。標記的一抗不常用，因此使用直接法ELISA時(shí)，需要為每個(gè)特定的ELISA系統標記一抗。

　　間接法ELISA

　　間接法ELISA檢測是在直接法ELISA的基礎上添加一個(gè)標記二抗進(jìn)行檢測，是目前的ELISA形式?？乖ㄟ^(guò)孵化被動(dòng)地附著(zhù)在孔上。洗滌后，抗原與抗原特異性抗體一起孵化。洗滌后，添加與酶共價(jià)連接的抗體，此抗體對第一次添加的抗體所產(chǎn)生的物種具有特異性，可以檢測所有結合的抗體。孵化和洗滌后，可以進(jìn)行測試和讀數。

　　與直接法ELISA類(lèi)似，間接法ELISA可用于抗體篩選、表位基因圖譜和蛋白質(zhì)定量檢測。二抗的作用是增強一抗的信號，使間接ELISA比直接ELISA更敏感。然而，它也會(huì )產(chǎn)生更高的背景信號，并可能降低整體信號。

　　夾心法ELISA

　　夾心法ELISA是最有用的免疫測定形式之一，它設計用于檢測可溶性抗原。根據使用的抗體數量，該ELISA有兩種形式。兩者的原理是相同的，一種是直接將抗原固定在固相上，另一種是將捕獲抗體固定在固相上以捕獲抗原。

　　? 直接夾心法ELISA(圖3a)中，捕獲抗體被附著(zhù)在固相上。洗去多余的未結合抗體后，加入的抗原被特異性捕獲。然后用第二種酶標記的抗體直接針對該抗原進(jìn)行檢測。這種類(lèi)型的檢測適用于有單一物種抗血清可用，且抗原不能很好地附著(zhù)在板上時(shí)。

　　? 間接夾心法ELISA(圖3b)中，通過(guò)第二種未標記的抗體來(lái)檢測抗原。該抗體則使用酶標記的偶聯(lián)物來(lái)檢測。重要的是偶聯(lián)物不能與捕獲抗體結合，因此產(chǎn)生捕獲抗體的物質(zhì)必須是不同的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，可以使用單一的抗偶聯(lián)物來(lái)檢測任意數量樣品中抗體的結合。

　　這種方法適用于抗原被其他蛋白質(zhì)污染或低濃度時(shí)。在這些情況下，抗原不能以足夠高的濃度直接附著(zhù)在固相上，以使用直接或間接ELISA進(jìn)行檢測。夾心ELISA依賴(lài)于具有至少兩個(gè)抗原位點(diǎn)的抗原，以便至少兩個(gè)抗體群可以與之結合。

　　競爭法ELISA

　　直接法ELISA是的ELISA形式?？乖ㄟ^(guò)一段時(shí)間的孵化被動(dòng)地附著(zhù)在酶標板孔底部。在簡(jiǎn)單的洗滌步驟后，通過(guò)添加與酶共價(jià)連接的抗體來(lái)檢測抗原。孵化和洗滌后，通過(guò)添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時(shí)間后，或在規定時(shí)間通過(guò)化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。

　　上述系統是ELISA的基本配置。所有這些都可以適用于使用競爭或抑制條件測量抗原或抗體，如圖4所述。隨著(zhù)溶液中游離抗原(抗體)量的增加，將與固定基質(zhì)結合的抗體(抗原)量會(huì )減少。在洗滌步驟之后，添加發(fā)色團底物以產(chǎn)生信號(顏色變化或光)?？贵w/抗原挑戰引起的信號變化揭示了競爭性抗原/抗體的信息。樣品中的抗原越多，最終孔底結合的參照抗原的抗體就越少，信號就越弱。

　　將可能含有抗原的未知樣品與含有已知量純化抗原的類(lèi)似樣品進(jìn)行比較時(shí)，競爭法ELISA適用于測量復雜混合物中的抗原濃度。

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