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實(shí)驗干貨—ELISA實(shí)驗過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題解答
ELISA實(shí)驗中會(huì )遇到很多問(wèn)題，不是這有點(diǎn)小問(wèn)題，就是那有點(diǎn)小問(wèn)題，那該怎么辦呢?以下便是天津本生技術(shù)小編是我們在多年的實(shí)驗過(guò)程中遇到問(wèn)題的總結：
Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標準品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分。標準品溶解、倍比稀釋時(shí)均需要渦旋震蕩以充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定。
Q2.標曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱，推薦孵育階段，使用ELISA用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標曲顯色，樣本不顯色
當樣本中目的蛋白濃度低或者樣本中干擾因素較強，就無(wú)法檢測到。目ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術(shù)結合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測靈敏度。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著(zhù)一定能檢測到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數值也更加可信。
Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大
這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護不規范，就會(huì )造成移液的誤差較大;實(shí)驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護。關(guān)于個(gè)人的操作可練習移液動(dòng)作、加快速度，確保移液的精密度。
Q5.本底偏高，樣本值測不到
標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過(guò)高會(huì )掩蓋目的信號，導致無(wú)法測到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀(guān)察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍色，即可終止反應。
Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)嬎愕玫降臉颖局挡町愝^大
有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋?zhuān)敲次覀兙蜁?huì )做下預實(shí)驗，確定稀釋倍數。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個(gè)稀釋倍數呢?
這里涉及到了基質(zhì)效應。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì )抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應較明顯。而經(jīng)過(guò)稀釋后，干擾因素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì )較小。當某兩個(gè)梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時(shí)，我們就可以認為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就更加測不到了，此時(shí)可按照廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方式操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，如果貿然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產(chǎn)生影響。
ELISA試劑盒本生公司產(chǎn)品種類(lèi)已超過(guò)萬(wàn)種，正廣泛應用于科研院校、中心實(shí)驗室、分子生物學(xué)等科研域。公司豐富的產(chǎn)品既能滿(mǎn)足研發(fā)類(lèi)客戶(hù)對產(chǎn)品種類(lèi)、包裝的特殊要求，也能滿(mǎn)足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。
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