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　　多色免疫熒光染色試劑盒使用說(shuō)明

　　酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類(lèi)利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對靶蛋白進(jìn)行標記的酶學(xué)檢測方法，類(lèi)似常規免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色"步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價(jià)結合，使樣品上穩定的共價(jià)結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價(jià)結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來(lái)第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實(shí)現多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周?chē)牡鞍讱埢?包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來(lái)催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價(jià)結合的抗體被洗掉，共價(jià)結合的熒光素穩定共價(jià)結合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，大大減少了實(shí)驗設計時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō)，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗，而且信號放大的倍數大大增強。茹創(chuàng )生物開(kāi)發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用?？梢詫?shí)現單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

　　試劑盒組成：

　　產(chǎn)品名稱(chēng)規格保 存備注

　　TYR-520熒光染料(綠光)(即用型)5mL-20℃TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 、TYR-690熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍。

　　TYR-570熒光染料(紅光)(即用型)5mL-20℃

　　TYR-690熒光染料(即用型)5mL-20℃

　　TSA+增強劑100ul-20℃(可選)

　　高敏多聚hrp山羊抗兔二抗5mL4℃

　　TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進(jìn)一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

　　操作流程：

　　1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲benⅠ15min-二甲benⅡ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內，酒精晾干后放入自來(lái)水中稍洗，蒸餾水洗。

　　2、 抗原修復：組織切片置于盛滿(mǎn)PH 9.0 EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進(jìn)行抗原修復(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min，?；?min，轉中低火7min，此過(guò)程中應防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織類(lèi)型以及抗原類(lèi)型來(lái)確定)。

　　3、 阻斷內源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

　　4、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈(防止抗體流走)，在圈內滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

　　5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過(guò)夜或者37度1-2h。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))

　　6、 加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。

　　7、 熒光染料反應：TYRXXX熒光染料反應10-15min，PBS洗三次。

　　8、 重復2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

　　9、 DAPI復染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

　　10、 封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　11、 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀(guān)察并采集圖像。

　　染料激發(fā)波長(cháng)發(fā)射波長(cháng)

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480450480

　　TYR-520綠色490520

　　TYR-570紅色550570

　　TYR-620590620

　　TYR-690630690

　　TYR-780750780

　　文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.