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推薦關(guān)鍵詞：熒光定量PCR耗材，實(shí)驗室耗材，PCR管，PCR板，本生生物PCR耗材
熒光定量PCR實(shí)驗步驟：
?、偃龃嬉蚜呀獾募毎?，室溫放置5分鐘使其*溶解。
?、趦上喾蛛x 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
?、跼NA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
?、躌NA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
?、軷NA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
?、奕芙釸NA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
?、?濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來(lái)測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
?、诩兌葯z測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定
?、僦颇z
1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
?、跍蕚銻NA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
?、垭娪?/p>
上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。
?、茏贤馔干涔庀掠^(guān)察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現DNA污染，將會(huì )在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
?、诨旌弦涸诩尤肽孓D錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
?、廴〕龊罅⒓?5℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR
?、?beta;-actin陽(yáng)性模板的標準梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
?、诜磻w系如下：
標準品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl 3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽(yáng)性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內參照上游引物F 0.5μl 3 內參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
?、壑苽浜玫年?yáng)性標準品和檢測樣本同時(shí)上機，反應條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應。
反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。
?、赑CR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
?、蹖CR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。 ①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應體系。
體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
?、趯⑴渲坪玫腜CR反應溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，后72℃7分鐘延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
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